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圍產期孕婦產前檢查B群鏈球菌(Group B Streptococcus)的 簡易高效快檢技術

2019.04.23
前言
由於B群鏈球菌(Group B Streptococcus, Streptococcus agalactiae, GBS,乙型鏈球 菌)可引起新生兒的肺炎(pneumonia)、腦膜 炎(meningitis)和敗血症(sepsis)以及產婦敗血 症及肺炎(圖1)[1, 2],美國疾病控制與預防 中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)建議懷孕35~37週之婦女需進行陰道

及/或肛門拭子的 GBS 檢測,以期在分娩前 施與抗生素。此措施成功地降低新生兒GBS 感染率達75%以上,也使致死率由1970年的 50%大幅下降至1990年的5% [3]。在台灣, 衛生福利部國民健康署也為了提升產前GBS 檢查的普及率,於2014年 4 月起將 GBS 檢 測費納入健保給付[4]根據美國CDC建議以及衛福部國健署委 託台灣醫事檢驗學會擬定的偵測B 群鏈球菌 標準作業流程[3, 5](圖2),建議以無菌棉拭 自陰道及/或直腸採檢後插入嗜氧檢體運送管 (aerobic transport medium),送到檢驗室後,先劃種血瓊脂平板(BAP),再將棉拭插入Lim broth(純增菌用)或carrot broth(增菌與鑑 別用),在35℃一般恆溫箱培養18~24小時 後,若 BAP 上有疑似 GBS 的 -溶血型菌落 則需進行CAMP (Christie, Atkins, and MunchPetersen)、hippurate(馬尿酸)水解或鏈球 菌分群試驗加以確認,如無發現疑似菌落, 則再將 Lim broth 增菌液再次移種一血瓊脂 平板,所有培養基均繼續培養18~24小時, 再發出最終報告。若接種carrot broth,則檢 視其是否顯色,若呈胡蘿蔔色即可報告為GBS 陽性,若呈陰性,則再接種 GBS DetectTM (Hardy公司,美國),若有 -溶血型菌落, 則需如同Lim broth所移種BAP上的疑似菌 落進行確認試驗,如無發現疑似菌落,則所 有培養基均繼續培養18~24小時,再發出最 終報告。

雖然美國CDC及衛福部國健署的建議流 程可將 GBS 的檢驗標準化,但所用的 Lim broth增菌培養基方法需經過多次移種培養確 認,將會延遲報告3~4天[6],而carrot broth 的接種需加一條促進產色紙條[7],以及所建 議移種的 GBS DetectTM 偽陽性高達58% (62/107) [8],造成檢驗人員的不便以及鑑定 人力與物力的浪費。由於使用嗜氧檢體運送 管運送檢體不能立即增菌,並可能讓產道或 腸道棲息菌增生進而干擾GBS的檢出。有鑑 於上述美國CDC及衛福部國健署建議方法的 諸多缺點,啟新生物科技有限公司(新北市, 台灣)遂設計孕婦產前檢查B 群鏈球菌的簡 易高效快檢套組,其係由運送裝置 CMPTM GBS TransCultSwab(GBS 的運送增菌培養 管)[9]結合 / GBS detection agar(偵測瓊 脂)[10] / GBS carrot agar(GBS 胡蘿蔔瓊脂)[11]分隔平板(Bi-plate)而組成,此套組以 簡易操作、高檢出率(分離率)及可縮短報 告時間與減少檢驗人員操作人力做為訴求。 本研究將評估 GBS TransCultSwab 結合 / GBS detection agar / GBS carrot agar分隔平 板的移種以確認其在臨床實際應用的有效性。

材料與方法 :

GBS檢驗套組的組成 GBS 簡易高效快檢套組的組成包括 CMPTM GBS TransCultSwab[9]與 / GBS detection agar[10] / GBS carrot agar[11]分隔平板,每一個孕婦使用一支GBS TransCultSwab 及一個分隔平板,分別介紹如下: GBS TransCultSwab(圖3A):GBS TransCultSwab(專利證書I627277號)是一 種結合採檢、運送、增菌與GBS假設性鑑定 四種功能的裝置,包裝中含有一支塑膠管, 內含可讓 GBS 增菌與即時抑制其它產道/直 腸棲息菌生長的培養基配方,以及使GBS的 -溶血株生長後顯色的成份,以半固體的方式 配製以利運送;裝置中另附一支無菌棉拭作 為採集產道及/或直腸分泌物檢體之用。醫師 採檢時將棉拭取出插入產道及(或)直腸約 2~3公分處旋轉兩圈採取足量分泌物後插至 含增菌培養基的塑膠管中,在室溫或35℃恆 溫箱暫時保存,然後在最短的時間內送至微 生物檢驗室,檢驗室收到此運送裝置,登記 相關資料後,置於35℃的一般或 CO2 恆溫 箱,培養5~24小時後可在任何時間內取出棉 拭移種至套組的分隔平板。 / GBS detection agar / GBS carrot agar 分隔平板:分隔平板中的 GBS carrot agar(專利證書I627277號)係針對GBS 溶血型菌株的偵測而設計的固體培養基,GBS carrot agar 含有特殊顯色基元可讓 -溶血型 GBS 的生長菌落呈胡蘿蔔色(圖3B 的右半 邊,呈米白色), / GBS detection agar(專 利證書I561634號)係針對GBS -溶血型菌 株的偵測而設計。含有綿羊血與特殊的溶血 加強液,可讓 -溶血型菌落轉變成 -溶血型 (圖3C的左半邊,呈紅色),而其接種方法 (圖3 之操作流程)為取出 GBS Trans CultSwab 的棉拭劃種分隔平板的兩邊各約 1/3,然後利用接種環操作三區劃線技術,最 後在分隔平板的第一區培養基各插種5~7次, 接著放在35℃的一般或CO2恆溫箱培養20~48 小時。由於其它少數菌在 / GBS detection agar 的生長菌落亦同樣地呈 -溶血,因此, 培養後任何懷疑的生長菌落需再進行適當的鑑定試驗(如CAMP試驗、馬尿酸試驗或血 清分群試驗)加以確認。
以臨床檢體實際評估GBS簡易高效快檢套組 從 2016年 4 月 1 日至2017年 3 月 31日 止,新北市某醫事檢驗所以CMPTM GBSTrans CultSwab 採檢744個產前 GBS 檢查檢體, 採集依產科門診的作業習慣暫時保存在室溫 或 35℃的一般或5 % CO 2 恆溫箱,再以常溫 方式運送至微生物檢驗室,放入35℃的一般 或 5% CO2 恆溫箱培養5~24小時。若中午前 收到檢體,則培養後在下班前一小時移種至 含 / GBS detection agar / GBS carrot agar 的分隔平板;若在中午後收到檢體,則培養 至次日早上移種。移種的方式如上述的分隔 平板使用說明。接著,將GBS TransCultSwab 與分隔平板培養置入35℃的一般或CO2 恆溫 箱培養20~48 小時,然後進行判讀,若在 GBS carrot agar的生長菌落呈橘~紅色,且 在 / GBS detection agar呈現 -溶血現象即 可鑑定為GBS(圖3B及表1),又若在GBS carrot agar的生長菌落不呈色,但在 / GBS detection agar 呈現 -溶血現象(圖3C 及表 1),則必須操作必要的鑑定試驗(如CAMP 試驗、馬尿酸試驗或血清分群試驗)加以確 認。
GBS 簡易、高效及快檢技術所用套組與傳統 檢驗方法的成本與效能比較 以操作100個產前GBS檢查檢體為例, 假設 GBS 陽性率為20%,將所評估的 GBS 簡易高效快檢套組與當前傳統檢驗方法進行 成本、操作方式、效能等比較。
結果 以臨床檢體實際評估GBS簡易高效快檢套組 利用 GBS 簡易高效快檢套組(結合 CMPTM GBS TransCultSwab與 / GBS detection
agar / GBS carrot agar 分隔平板)在12個月 間共評估744 個臨床產前檢查檢體,結果發 現孕婦的 GBS 檢出率(陽性率)為 24.32% (181/744),月的檢出率約介於18.60%~33.33%。 (表2)
GBS 簡易、高效及快檢套組與公告的傳統檢 驗方法、成本與效能比較 以操作100個產前 GBS 檢查檢體為例,假設GBS陽性率為20%,將GBS簡易、高效 快檢套組與公告的傳統的 GBS 檢測方法進行 成本與效能比較,傳統檢測方法為利用嗜氧 運送管採檢及運送,送至檢驗室後接種血平 板或顯色平板(CHROMagar StrepB)以及Lim broth或carrot broth,培養後進行判讀,結果 顯示 GBS 簡易高效快檢套組在操作時間、檢 出率、報告時效、成本以及簡易性等項目皆 優於公告的傳統GBS檢測方法。(表3)。

討論

GBS 的孕婦帶原者約為15~30%[12-17], 醫師對帶原者常用的預防用藥為 penicillin [3],其施用時機為分娩前4 小時,但若孕婦 對其過敏,則檢驗室需提供其它適當藥物的 藥敏型式。又如果發生早產,羊水提早破裂, 胎兒很可能因此受到感染。因此在孕婦產前 GBS檢查的正確性與快速性對預防性抗生素 的應用將具有重要性。 傳統孕婦產前GBS檢驗方法為採檢後送 至檢驗室立即接種BAP或其它選擇區分性顯 色瓊脂(如CHROMagar StrepB),然而兩 者 GBS 檢出率不高,僅為7.5%[18]以及 9.7~11.8%[19],且BAP 與顯色平板生長菌落 對 GBS 均不具有特異性,前者為滋養培養 基,革蘭氏陽性及陰性菌都可以生長,而後 者有許多其它菌如Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes (GAS)、Group G Streptococcus (GGS)、Staphylococcus aureus、 S. epidermidis與Stenotrophomonas maltophilia 的生長菌落也呈現與GBS同樣的紫色菌落形態,而無法彼此區分,CHROMagar StrepB 顯色瓊脂的特異性僅達70% (24/40)[11],此 發現與CHROMagar StrepB顯色瓊脂的使用 說明一致[20]。因此,在實際應用時,任何紫 色菌落在CHROMagar StrepB的出現還需進 行 CAMP 或 hippurate 水解等鑑定試驗以確 認分離菌為GBS,此額外試驗將延遲檢驗報 告 1 天,也更浪費人力及物力。另外,林等 [21]以 PCR DNA方法檢測晚孕期陰道B 群鏈 球菌的定植分別發現其檢出率為14.1% (288/1,472),而楊等[22]及季等[23]應用即時螢 光定量PCR技術指出GBS的陽性率為13.5% (85/600)與 4.17% (377/9,073)。分子診斷技 術雖然快速獲得檢測結果,但檢出率不高, 且萃取檢體中的菌體DNA,不僅費時、成本 高、須有昂貴的設備與良好的實驗室環境以 及勝任的操作人員,且無法即時獲得進行藥 敏試驗所需的GBS生長菌落,美國的疾病管 制署(CDC)[3]並不建議使用分子檢測方法直 接從孕婦產前檢體偵測GBS。 本研究指出GBS簡易、高效快檢套組證 實 CMPTM GBS TransCultSwab具有採檢/運送/增菌及假設性鑑定 GBS 的效能,檢驗人 員的使用將不需再移種增菌培養基(Lim broth 或carrot broth),也不需如同美國Hardy生產 的carrot broth需額外插入加強顯色紙條,因 此 GBS TransCultSwab的操作堪稱簡易、方 便與親民(user friendly)。另外,GBS Trans CultSwab移種的分隔平板中GBS carrot agar 偵測 -溶血型GBS的特異性高達100%[11], 因此,任何橘~紅色的生長菌落可藉著顯色特徵快速檢出GBS。GBS除了 -溶血型外, 尚有3~5%屬於非( )溶血型[3],此可藉者分 隔平板的 / GBS detection agar快速偵測, 因此,檢測套組對GBS的偵測是全面性的, 雖然美國Hardy Diagnostics已研發可用於偵 測 溶血型GBS的區分性培養基-GBS DetectTM (平板培養基),發現 溶血型 GBS 從孕婦 檢體的檢出率為3.9% (24/619),但因其偽陽 性高達58% (62/107)[8],將導致檢驗人力的浪費及偽陽性的產生,綜合以上及本研究之 臨床744件檢體測試結果,使用 GBS Trans CultSwab搭配 / GBS detection agar / GBS carrot agar 分隔平板的移種,對GBS偵測率 (檢出率)高達24.32%。(表2) 過去研究曾指出Enterococcus spp.(腸 球菌)的菌量高於 -溶血型GBS十倍時會干 擾(掩蓋或抑制) -GBS在 GBS carrot agar [11]和GBS TransCultSwab的顯色能力[24-26]。 推測Enterococcus spp.干擾 -GBS的原因可 能為其等同屬一個菌科,生長條件相同,且 在增菌培養基的生長速度相近之故,但在相 等菌量存在時則不影響顯色。目前尚無法從 配方的改變加以改善,但運送管增菌培養5 小時後,搭配 / GBS detection agar / GBS carrot agar的三區劃線法移種,將可隔離GBS 與 Enterococcus spp.,而避免後者的干擾 [25], -GBS雖然在carrot agar不顯色,但可 在 / GBS detection agar產生 -溶血型菌落, 只要進行必要的 CAMP、馬尿酸(hippurate) 水解或鏈球菌血清分群試驗將可立即加以區 分[10]。 孕婦產前檢查GBS分離率受到各種因素 影響[12],包括(i) 醫師或護理師的採檢技術: 此因素影響GBS分離率最大,如果僅採集產 道,應該將棉拭深入產道內2 公分,慢慢旋 轉 2 圈已得到最大量的分泌物為原則;如果 用同一支棉拭採檢直腸部位檢體,也是操作 同樣的採檢技術。有些醫師欲分別得到產道 與直腸的檢體,則共取2 支無菌棉拭採檢。 (ii) 特殊增菌與分離培養基的使用:GBS 的 棉拭檢體不能直接接種平板培養基,必須先 經過增菌,才能移種或操作real-time PCR。 增菌肉湯培養基包括carrot broth, Lim broth, Trans-Vag broth 以及本研究所建議的 GBS TransCultSwab,分離培養基則包括CHROMagar StrepB、BAP、CNA、PEA、GBS DetectTM以 及本研究所建議含 / GBS detection agar/ GBSCarrot agar的bi-plate,其中GBS DetectTM、 bi-plate 與 CHROMagar StrepB 均能測出 GBS,但因兩者偽陽性高,因此均需要挑取 GBS懷疑菌落進一步操作確認試驗(如CAMP 試驗)。(iii) GBS檢測的操作技術以及檢驗 人員的訓練與經驗:如果直接將棉拭檢體接 種 BAP 等分離培養基或操作 PCR 等分生技 術,GBS分離率僅約7~10%左右;如果僅用 GBS TransCultSwab 的培養結果,在醫師正 確採檢技術及檢驗人員對判讀有6 個月以上 經驗的條件下,GBS分離率為18.63% (30/161) [9]以及18.28%[21],如果沒有足夠的判讀經 驗,分離率約為11.03%[21],因此,GBSTrans CultSwab 應該配合 / GBS detection agar/ GBS Carrot agar的 bi-plate的移種才能夠達 到本研究所顯示的高GBS分離率(24.32%)。 (iv) / GBS detection agar/ GBS Carrot agar 的bi-plate接種技術:由於是分隔培養基,因 此選用三區劃線技術,移種的第一區約佔表 面積的1/3,然後將接種環滅菌冷卻後再塗畫 第二區,同樣地,再次將滅菌環滅菌後再塗 畫第三區,最後在第一區插種5 次,以便獲 得無氧環境,更利於 -GBS 在 bi-plate 分別 產生橘-紅色[11]及產生 -溶血環。(v) 棉拭檢 體需有足夠的增菌時間:無論在carrot broth, Lim broth, Trans-Vag broth 以及GBS Trans CultSwab均需要培養在35~37℃的CO2 培養 箱,肉湯培養基須培養20~24小時,而GBS TransCultSwab則培養5~24小時,才能移種 至CHROMagar StrepB、BAP、CNA、PEA、 GBS DetectTM 之一的分離培養基。以及(vi) 延長培養時間及再次移種:GBS 檢測的棉拭 檢體經過增菌、移種及培養後如果沒有顯示 生長,增菌培養基最好延長培養一天,然後 再進行平板培養基的移種及培養後的觀察。 總之,除了提高GBS的檢出率、有能力 偵測 -溶血型 GBS 以及避免 Enterococcus spp.的干擾外,本研究亦發現此套組的分隔平板在培養隔日即可鑑定出GBS,其陽性生 長菌落可隨即用於操作藥敏試驗,如此,將 可縮短至少一天的報告時間,並且GBS Trans CultSwab 運送管與 GBS carrot agar 上的顯 色及在 / GBS detection agar呈現的 -溶血 特徵將可做為三重複確認(triple-check) GBS 的存在,由於檢驗人員僅需移種一次,且花 費時間僅約15秒,對檢驗人員堪稱方便,操 作人員僅需稍微訓練即能進行檢驗工作,因 此,對臨床檢驗室而言,GBS TransCultSwab 結合 / GBS detection agar / GBS carrot agar 的移種將具備簡易、快速及高通量(highthroughput)檢測的優點,值得臨床檢驗室加 以應用,以便將陽性檢驗結果即時提供醫師 做為預防新生兒與孕婦感染的參考。

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